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纳百恩公司建议在纳豆行业中推广:纳豆激酶活性(NKIU)测定方法

纳百恩公司建议在纳豆行业中推广:纳豆激酶活性(NKIU)测定方法

作者:
张迎庆
来源:
原创
2019/01/07 23:26
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【摘要】:
在国内较为适宜的方法是采用琼脂糖-纤维蛋白平板法,并以可官方获取的尿激酶为标准品的来测定纳豆激酶的活性,该法可以通过在体外模拟人工血栓平板上产生的透明圈直观定量测定溶栓效果,方法便捷可靠,单位命名为NKIU(NK是纳豆激酶英文缩写)。为此,特在纳豆行业中推广。

纳豆激酶活性测定的方法有多种多样,原理也各不相同。主要有纤维蛋白平板法、纤维蛋白块溶解时间法、四肽底物法、血清板法、酶联免疫吸附法及紫外分光光度法。其中纤维蛋白块溶解时间法不够精确,一般用于粗酶的活性测定;四肽底物法不完全符合人体的血栓环境,测得的结果与实际有些差异;血清板法对人工血栓的制作要求较高;酶联免疫吸附法价格较贵;在日本采用较多的是紫外法,采用FU为单位,但由于必须采用日本官方健康营养食品协会的标准品进行校正,而标准品官方不对外提供,因此无法在国内用FU计量。且一些保健食品中的其他组分也可能因在该测定吸收波长处产生干扰,影响其准确性,这些因素限制了该方法的推广使用。因此,在国内较为适宜的方法是采用琼脂糖-纤维蛋白平板法,并以可官方获取的尿激酶为标准品的来测定纳豆激酶的活性,该法可以通过在体外模拟人工血栓平板上产生的透明圈直观定量测定溶栓效果,方法便捷可靠,单位定为NKIU(NK是纳豆激酶英文缩写)。为此,特在纳豆行业中推广。

 

 

琼脂糖-纤维蛋白平板法测定纳豆激酶溶栓活力方法

 

琼脂糖-纤维蛋白平板法是目前最常用的纤溶酶溶栓活力的测定方法,也是最早用于纳豆激酶溶栓活力的测定方法之一。琼脂糖-纤维蛋白平板法的原理是用琼脂糖作为固体支持,以凝血酶和纤维蛋白原作用后制成人工血栓平板,取纳豆激酶样品点于平板上,恒温孵育一段时间后,用溶解圈垂直直径的乘积来表示溶栓活力。本方法以尿激酶(Urokinase,UK)作为对照标准品,纳豆激酶(Nattokinase,NK)的活性单位换算成相当于标准品的单位数(定义为NKIU)。

一、试剂与仪器

1.1试剂

牛凝血酶(190BP/支), 牛纤维蛋白原(98mg可凝蛋白/支),尿激酶(1280IU/支),琼脂糖,硼酸,硼砂(四硼酸钠)

1.2仪器设备

高速离心机,全自动生化培养箱

1.3工作溶液配制

(1)50mM硼砂缓冲溶液(pH7.8,含150mMNaCl)

取0.05M硼砂20mL,0.2M硼酸80mL,加NaCl 0.8766 g,混合后制得。

(2)牛凝血酶(1BP/mL)

1支牛凝血酶(190BP/支)加入1.9mL硼砂缓冲溶液(pH7.8,含150mMNaCl)溶解得100BP/mL,取10uL稀释至1mL,得1BP/mL。

(3)纤维蛋白原溶液

1支纤维蛋白原(98mg可凝蛋白/支)加3.27mL硼砂缓冲溶液(pH7.8,含150mMNaCl)溶解得30mg/mL,取0.5mL稀释至10 mL,得1.5mg/mL纤维蛋白原溶液备用。

(4)1.5%琼脂糖

1.5 g琼脂糖加入100mL生理盐水,微波加热溶解,55℃备用。

(5)尿激酶标准溶液

取1支尿激酶(1280 IU/支)加生理盐水配制得到19.2 IU/mL, 38.4 IU/mL, 57.6 IU/mL, 76.8 IU/mL, 96.0 IU/mL尿激酶溶液。

 

二、实验方法

2.1样品处理方法

取供试品6粒,剪破内容物和外壳一并放入烧杯,加入10mL生理盐水浸提(4℃,4h),5000 rpm离心20min,取上清备用。

2.2 琼脂糖-纤维蛋白平板制备方法

55℃保温平衡的1.5%琼脂糖40mL,加入纤维蛋白原(1.5 mg/mL)40mL,以及凝血酶(1BP/mL)4mL,迅速倒入平板中,4℃冷却30min,备用。

2.3加样、培养、计算方法

空心毛细管在平皿上打孔,直径为2 mm。在孔内分别加供试品溶液和标准品溶液,精密量取不同浓度的尿激酶标准品溶液及供试品溶液各10mL,分别点在同一平皿中,加盖,置37℃恒温箱中反应18h。取出后用卡尺测量溶圈垂直两直径,以尿激酶标准品单位数的对数为横坐标,垂直两直径乘积的对数为纵坐标,计算回归方程,将供试品垂直两直径乘积的对数代入回归方程,计算供试品效价单位数。标准品各做两点,供试品做三个点,以平均值计算。通过回归方程,根据供试样品量及定容体积, 计算样品中纳豆激酶活力。

供试品溶栓活力(NKIU尿激酶/粒)=供试品效价(IU/mL)×定容体积(mL)/粒数

 

张迎庆简介

张迎庆(1969-),女,博士,教授,湖北工业大学生物工程与食品学院副院长。

湖北省药学会生化制药专业委员会委员。2005年入选湖北省新世纪高层次人才工程(第三层次)。2001-2002年赴波兰雅盖隆大学医学院留学进修天然药物。获湖北省科技进步二等奖1项(第3完成人);湖北省科技进步三等奖1项(第5完成人);湖北省优秀教学成果三等奖1项(第1名);主持完成省级科研项目3项,其中1项鉴定为国际先进水平;参与完成国家级及省级项目12项;主持横向科研8项,公开发表论文SCI等三大检索收录论文10余篇。获授权国家发明专利2项。