纳豆激酶溶栓活力测定方法的研究现状

魏 华1 ，赵祥颖2 ，刘建军1*2

(1.山东轻工业学院食品与生物工程学院 济南 250100)

(2.山东省食品发酵工业研究设计院 济南 250013)

摘 要：归纳总结了目前关于纳豆激酶溶栓活性测定的各种方法，并简介人体溶栓过程的生理学背景和医学上检查血栓病情的各种常用方法，有待继续研究并建立一种更精确、更灵敏、更简便、更经济的NK溶栓活力的测定方法。

关键词：纳豆激酶、活性测定、溶栓活性

The Detecting Method of Nattokinase Thrombolysis Activity

WEI Hua1 LIU Jian-jun2 ZHAO Xiang-ying2

(1 Department of food and bioengineer,Shandong institute of light industry ,jinan 250100 China;2 Shandong Food Ferment Industry Research & Design Institute，jinan 250013 China )

Abstract: The detecting methods of nattokinase thrombolysis activity commonly used now is summarized. It introduces about the physiological background of demic fibrin solution system and the medical checking methods of thrombi .A detecting method of NK activity of more precise,sensitive,convenient and economic is needing to be research and set up finally.

Key words: nattokinase, determination of activity , acivity of thrombolysis

纳豆是日本的一种具有2000多年悠久历史的传统营养食品，源于我国的发酵食品--豆豉,它由蒸煮熟的大豆接入枯草芽孢杆菌或者纳豆菌后发酵而成。纳豆以其丰富的营养、多样的生理调节机制以及神秘的药效而闻名于世，很久以来，民间就将其作为预防和治疗心脑血管疾病的药品。1987年须见洋行教授首次从纳豆中提取出具有溶栓活性的蛋白激酶，并将其命名为纳豆激酶(简称NK)[1]。基于纳豆激酶的纤溶活性和溶栓能力，国内外学者们已经在纳豆激酶的发酵工艺,提取纯化,生理生化,药理药效,基因克隆和表达及产品开发等多方面进行了深入地研究,并取得了很好的进展。而纳豆激酶的活性测定方法的研究又是所有研究

作者简介： 魏华(1983-)，女，济南，在读硕士研究生，工业微生物育种

*通迅作者： 刘建军，男，教授，山东省济南市解放路41#(250113)

的基础，从其建立之后不断地得到了改进，但依然有待继续研究并最终确立一种更精确、更灵敏、更简便、更经济的NK溶栓活力的测定方法。

1 纳豆激酶溶栓活力的测定方法

目前国内研究者们所使用的纳豆激酶的溶栓活力的测定方法有琼脂糖-纤维蛋白平板法、血清板法、纤维蛋白块溶解时间法(CLT)、四肽底物法、酶联反应吸附法等等，现在归纳总结如下：

2.1 琼脂糖-纤维蛋白平板法

琼脂糖-纤维蛋白平板法是根据Astrup(1952)方法改进的，是目前最常用的纤溶酶溶栓活力的测定方法[2]，也是最早用于纳豆激酶溶栓活力的测定方法之一[1]。纳豆激酶溶栓活力的测定方法是参照尿激酶(UK)、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的测活方法建立的。纤维蛋白平板法也是目前国家卫生部测定尿激酶及蚓激酶等溶栓酶活力的标准方法。

琼脂糖-纤维蛋白平板法的原理是用琼脂糖作为固体支持,以凝血酶和纤维蛋白原作用后制成人工血栓平板，取NK样品点于平板上,37℃恒温孵育18h,用溶解圈垂直直径的乘积(mm2)来表示纤溶活力。以标准NK或UK或纤溶酶作为标准品作标准曲线。NK的活性单位定义为: 在37℃1min内分解1nmol 溶解于0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.4)中的浓度5×10-4mol/L的H-D-Val-Leu-Lys-pNA的NK量为1U。或者换算成相当于标准品的单位数(定义为IU)[3] 。

此法简便易行，并可同时测定多个样品，但由于溶解圈面积完全是表观值，受恒温孵育时间影响很大.当恒温时间增加时,对应值反而会显著减少，因此对恒温时间的控制是十分重要的。与NK精制产品相比, 粗制酶活性测定受孵育时间影响更大, 这可能是由于粗酶中杂质的影响[4]。

2.2 纤维蛋白块溶解时间法(CLT法)

纤维蛋白块溶解时间法(CLT)是根据纤溶酶、t-PA、UK等溶血栓物质的活性测定方法改进的[3] 。

0℃下, 在小试管中依次加入凝血酶、硼酸生理盐水缓冲溶液、NK溶液和纤维蛋白原,强烈搅拌,置于37℃恒温水浴。从纤维蛋白形成开始计时,随着反应液混浊,有气泡上升到液面,到气泡停止冒出时,作为纤维蛋白溶解时间(CLT)。同样以标准NK或UK或纤溶酶作为标准品,以CLT对NK浓度的对数作图,发现在10～70μg范围内有很好的线性关系。

此法迅速快捷,分辨率较大,更适于粗酶的活性测定，但由于需要精确判断反应时间，所以不太适合灵敏度要求较高的样品的活性测定，也不方便多个样品的同时测定[4]。

2.3 四肽底物法

四肽底物法是根据枯草杆菌蛋白酶E的酶活测定方法[5]改进的。

在四肽底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA溶液中加入NK溶液,置于37℃水浴中孵育1min，测定单位时间内410nm处光吸收的变化。NK的活性定义为1min,水解该四肽底物时生成1μL硝基苯胺的NK量为1U。

该法简便迅速，但不能完全反映其纤溶活性,其纤溶活性与所测得的蛋白酶活力之间是否有相关性有待进一步试验[6]。

2.4 血清板法

血清板法是根据纤维平板法改进的[7]。

血栓纤维在655nm处有最大吸光度值,随着纤维的溶解,吸光度会相应地降低。将血清板制成微型纤维平板,然后在每个孔内注入NK溶液及标准品。反应开始4h内,每30min测定一次OD655值;计算出不同时间的OD655值同初始OD655值的差-ΔOD655,利用最小二乘法算出直线的斜率—ΔOD655/h。以此斜率与NK浓度的对数建立线性关系。

该法简便快捷,样品消耗小,成本低，可信度高，可同时测定多个样品。但人工血栓的制备对吸光值的测定有一定影响，当反应开始时小孔内的血栓的吸光值在0.2以上时, 人工血栓的调制对OD655值影响不大。

2.5 酶联免疫吸附法( ELISA)[8]

将NK特异性的单克降抗体吸附在微孔板上，用BSA-PBS冲洗并封堵未被吸附的部位，加入NK样品，使之与单克隆抗体结合，再加入连有过氧化氢酶的多克隆抗体与两者结合。然后加入新配制的底物溶液和H2SO4 , 测定490nm 的吸光值。

该法灵敏度很好,但操作复杂, 成本高。

2.6 Flion-酚法

Flion-酚法依据经典的测定枯草芽孢杆菌的蛋白酶活力方法。

原理是在一定的温度和pH条件下，蛋白酶水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，Flion-酚试剂极不稳定，易被酚类化合物还原成钼蓝与钨蓝，根据蓝色的深浅测定680nm处的吸光度可以推断酶活力的大小。用标准的不同梯度浓度的酪氨酸溶液作标准曲线。蛋白酶活力单位的定义：40℃，pH7.5的条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪蛋白的酶量为一个酶活力单位，以U/g表示。

此法简单易行，可以同时测多个样品，成本低，但需要严格控制酶解时间，并且不能完全表示为纤溶酶活力，经实验证明此法测得的蛋白酶活力与纤溶活力之间存在一定的相关性[9]。

另外，陈颖萍等[10]研究发现与尿激酶相比，纳豆激酶的作用并非只是激活纤维蛋白溶酶原，而是对纤维蛋白的直接溶解作用，因此用尿激酶作为标准品检测酶活力也是存在一定的误差。虽然酪蛋白不是纤维蛋白，但作为蛋白溶解酶活力测定反映的底物，是测定方法更加快速简便经济。

2.7 聚丙烯酰胺纤维蛋白平板法

赵明等[11]在琼脂纤维蛋白平板的基础上，用聚丙烯酰胺代替琼脂作载体，用平板电泳制胶模具代替玻璃或塑料平皿，制作能严格控制厚度、均匀的薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白平板，并用蛋白染色法指示纤维蛋白溶解情况。

此法灵敏度高、通量大、重现性好、易于标准化、样品用量少、设备简单、操作简便及可定量分析等优点，适用于纤溶酶类药物的初筛、跟踪检测活性成分和测量相对纤溶酶活性等。

2 溶栓过程的生理学背景及血栓性疾病的检查方法

纤维蛋白溶解系统(fibrinolysis system)是人体最重要的抗凝系统，由yixia4种主要部分组成：纤溶酶原(plasmingen)、纤溶酶原激活剂(plasmingen activator, 如t-PA, u-PA)、纤溶酶(plasmin)、纤溶酶抑制物(plasmin activator inhibitor, PAI-1, antiplasmin)。凝血过程中形成的纤维蛋白结块，在tPA的存在下, 纤溶酶原激活转化为纤溶酶。纤溶酶将纤维蛋白凝结块从精氨酸-赖氨酸键上分解形成各种可溶片段, 使血栓溶解，形成纤维蛋白产物(FDP)。FDP由下列物质：X-寡聚体(X-oligomer)、D-二聚体(D-Dimer)、中间片段(Intermediate fragments)、片段E(Fragment E)组成。其中, X-寡聚体和D-聚体均含D-二聚体单位。溶栓治疗是指用药物来活化纤维蛋白溶解系统。

纤溶酶溶栓活力的测定方法就是根据纤维蛋白溶解系统的生理过程建立的。纳豆激酶作为一种纤溶酶，其溶栓活力的测定方法又是在其他纤溶酶溶栓活力的测定方法的基础上建立并改进的。同时纳豆激酶作为一种蛋白酶，又可以用经典的其他蛋白酶活力测定方法，如测定枯草芽孢杆菌蛋白酶活力的Flion-酚法。而医院是通过检测血液中的纤维蛋白降解产物的含量来检查血栓类疾病情况的。

依据纤维蛋白溶解系统的生理过程，医学上检查血栓疾病的方法通常通过测定血液中纤维蛋白产物(FDP)的含量，来定量反映药物的溶栓效果、及可用于诊断、筛选新形成的血栓。纤溶酶降解纤维蛋白凝结块形成各种可溶片段, 形成FDP(由X-寡聚体、D-二聚体、中间片段、片段E组成)。其中, X-寡聚体和D-聚体均含D-二聚体单位，FDP中唯D-二聚体交联碎片可反映血栓形成后的溶栓活性，D-二聚体可作为溶栓效果的定量监测指标。

目前常用的D-二聚体的检测方法如下：

2.1乳胶凝集法

原理是被检血浆中D-二聚体与包被在乳胶颗粒上的单抗相作用, 产生絮状沉淀反应。

此法快速，但只是定性实验; 半定量测定须多次倍比稀释测定费试剂, 且结果重复性差。

2. 2联免疫吸附法(ELISA)

原理是采用2 个针对D-二聚体的单抗建立的抗原为中心,两种抗体夹心法,并加入辣根过氧化酶的底物以作显色反应。

此法操作步骤复杂、费时,抗原抗体反应受温度时间影响，而且每次实验需带标准曲线,因此需留一批标本同时测定,不适用于临床病人及时诊断及治疗的需要。

2. 3NycoCard D-二聚体测定

原理是免疫过滤胶体金显色反应法采用同种抗体夹心,即以包被的抗体捕获血浆中抗原(D-二聚体),加入偶联有胶体金的同种抗体显色。 因此也是以抗原为中心,抗体为三明治两侧,但为同种抗体。因抗体特异性高,可与含D-二聚体的 多种片断结合使试验灵敏度增高。虽偶可与D片断结合,但不发生挂钩现象。

此法快速且检测定量,灵敏度高无挂钩,不高温溶，但特异性不强，受脂质颗粒干扰，肉眼比色结果可信度差。

2.4胶体金免疫过滤检测法

此法快速测定、灵敏度高、阴性预报值高，重复性良好，临床医师较多采用。

3 结 语

综上所述，多种纳豆激酶的酶活测定方法各有其优点和应用范围，但每种方法也有一定的局限性，从而限制了其广泛应用。确定一种精确灵敏简捷又经济的纳豆激酶的溶栓活力测定方法依然有待于进一步的研究实践。