潘特林在醛固酮诱导的高血压病理生理学中的作用

长期以来，期望逆转（或至少延缓）衰老进程是生物学和顺势医学研究的焦点。在构成肾素-血管紧张素-醛固酮系统的分子中，血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）的作用一直是研究热点，因此人们对AngⅡ信号转导在不同组织和器官中的特征进行了详细报道^[3]。然而，过去几十年的研究结果表明，醛固酮和MR在血压控制方面与AngⅡ一样重要。醛固酮是由Simpson等人在1953年首先分离出来的^[4]，其后不久，Conn报道了首例由醛固酮腺瘤导致的原发性醛固酮增多症（primary aldosteronism，PA）^[5]。1960年，Laragh等人考察了升压及降压物质对醛固酮分泌的影响，证实AngⅡ可不断促进醛固酮分泌^[6]。纯化醛固酮30多年后，Arriza等人在1987年克隆出MR基因^[7]，这为研究该受体在高血压病理生理中的作用提供了新机会。

20世纪90年代至21世纪10年代，通过一系列人类基因分析确定了引起家族性低血压和高血压的基因^[8]。令人惊讶的是，尽管血压调节系统的作用机制众多，但相关的基因却聚集在富含远端肾单位（包括MR和下游靶分子）或参与醛固酮生物合成的分子中^[8]。此外，编码醛固酮合成酶、MR和ENaC的基因发生突变时可引起先天性低血压和高血压，支持醛固酮-MR系统是一种强大的血压调节机制这一论断。

PA的流行病学研究表明，醛固酮在一般人群的高血压发生中发挥着重要作用。尽管PA最初被认为是一种相对罕见的疾病，在高血压患者中的发生率不到1%，但越来越多的数据表明其发生率更高。1994年，Gordon等人在199例血清钾（K+）水平正常的高血压患者中评价了发生PA的可能性，报告PA的患病率为8.5%~13%^[9]。

Nishikawa等人也在一个日本队列中发现PA在高血压病例中的发生率高于预期^[10]。Rossi等人进行的意大利原发性醛固酮增多症患病率（Primary Aldosteronism Prevalence in Italy，PAPY）研究是一项前瞻性研究，报告在1,125例接受检查的患者中，分别有54例（4.8%）和72例（5.4%）患者患有醛固酮腺瘤和特发性醛固酮增多症^[11]。此外，该研究还表明约20%的3级高血压病例被诊断为PA^[11]。值得注意的是，在血压正常的受试者中进行的弗雷明汉队列研究的结果显示，即使是生理范围内的醛固酮水平增加，也增加高血压发生的风险^[12]。鉴于PA患者心血管疾病和肾脏损害的发生率高于原发性高血压患者，有必要进行早期诊断和干预，以期改善预后^[13,14]。

应用MR拮抗剂的干预研究进一步证实了醛固酮和MR在高血压发病机制中的作用^[15-17]。PATHWAY-2研究是一项双盲、交叉研究，目的为在肾小球滤过率估算值≥45 ml/min/1.73 m2的受试者中确定难治性高血压的最佳治疗方案^[17]。该研究中，患者在12周内轮流服用螺内酯、比索洛尔、多沙唑嗪和安慰剂^[17]，结果表明，螺内酯治疗后收缩压较基线明显降低，效果优于安慰剂和其他2种药物，证明MR拮抗剂是治疗难治性高血压最有效的叠加治疗药物。在亚组研究中，研究者提到可根据低血浆肾素水平（r²=0.11）和醛固酮-肾素比值（r²=0.13）预测对螺内酯的降压反应，而单纯血浆醛固酮的预测力较弱（r²=0.025）。总之，如前所述，数据表明醛固酮分泌过多（相对于盐摄入）和/或MR异常激活参与了难治性高血压的发生^[18]。

在另一研究中，Fujita等人阐述了依普利酮（另一种MR拮抗剂）对非糖尿病肾病伴高血压患者的影响（EVALUATE研究）^[16]。这一入选了336例患者的随机、双盲、安慰剂对照试验表明，在肾素-血管紧张素系统抑制剂的基础上叠加低剂量的依普利酮，可有效减少蛋白尿、降低血压，且该疗效与醛固酮水平无关。在对此研究的亚组分析中，Nishimoto等人阐述了盐负荷对MR阻断剂的作用^[15]。他们发现，钠排泄量三分位数最高组中接受依普利酮治疗的患者尿白蛋白减少和血压降幅显著大于相同三分位数组中接受安慰剂的患者。因此，MR的信号通路参与了先前所述的、盐诱导的对肾素-血管紧张素系统抑制剂抵抗的病理生理过程^[19]。

目前已知连接小管和皮质集合管中的闰细胞通过调节向尿液中排泄的H+和HCO3ˉ而调节酸碱平衡。上世纪70~80年代的生理学研究证明，大鼠和兔子的皮质集合管在酸性条件下可重吸收HCO3ˉ，在碱性条件下可分泌HCO3ˉ^[20-22]。后来的研究显示，该段的顶端膜或基底侧膜中有表达H+-ATP酶的细胞^[23]，前者称为α-闰细胞，后者称为β-闰细胞。α-闰细胞中的H+-ATP酶含有V型H+-ATP酶B1亚基（ATP6V1B1），ATP6V1B1基因发生突变可导致常染色体隐性遗传性远端肾小管酸中毒^[24]。在这些细胞中，顶端膜泌酸与基侧膜重吸收HCO3ˉ有关。此过程被证明是由阴离子交换体1（anion exchanger 1，AE1）蛋白（SLC4A1）（一种Clˉ/HCO3ˉ交换体）介导的^[25]。常染色体显性遗传性肾小管酸中毒是由AE1基因突变所致^[26,27]。

相比α-闰细胞，β-闰细胞可分别在顶端膜和基侧膜表达Clˉ/HCO3ˉ交换转运体和H+-ATP酶。在这些细胞中，顶端膜的Clˉ/HCO3ˉ交换过程是由一种名为潘特林（SLC26A4）的跨膜蛋白介导的。这种蛋白之所以如此命名，是因为发现潘特林有缺陷时可导致Pendred综合征，这是一种以甲状腺肿和先天性听力丧失为特征的常染色体隐性遗传病。1896年，Vaughan Pendred医生报告了首例这种综合征，由此得名^[2]。Pendred综合征是最常见的综合征性耳聋，估计其发病率为每100,000人7.5例。1997年，Everett等人揭示了其致病基因^[28]，使得人们对肾脏闰细胞功能的认识有了重大进展。潘特林负责电中性的Clˉ/HCO3ˉ及Clˉ/Iˉ交换。最初，人们注意的是它在甲状腺和内耳中的作用^[29]，但后来的研究确认，潘特林是在连接小管和皮质集合管的β-闰细胞和非α、非β-闰细胞中表达的^[30]。

与肾脏闰细胞在调节酸碱平衡中的预期一样，最初认为潘特林对连接小管和皮质集合管的泌碱很重要。但后来的研究表明，潘特林通过介导Clˉ的重吸收，在体液调节中也发挥着重要作用。Wall等人首次证明，限制NaCl时，相比于野生型小鼠，潘特林缺陷型小鼠NaCl的排泄增加而血压降低^[31]。同样，去氧皮质酮（一种醛固酮类似物）对潘特林敲除小鼠引起的升压反应减弱，但碱中毒加重^[32]。后来多种基因修饰动物模型的研究证实了潘特林的血压调节作用。Jacques等人利用ATP6V1B1启动子培育了表达潘特林的转基因小鼠模型^[33]，这种小鼠在高盐饮食时表现为尿钠增加延迟和高血压。Soleimani等人培育了钠-氯协同转运蛋白和潘特林双敲除小鼠，并报道了他们的表型^[34]，与单纯敲除钠-氯协同转运蛋白或潘特林的小鼠相比，双敲除小鼠出现严重的失盐和血容量减少，且通过补盐可纠正^[34]。在我们的研究中，我们证实了潘特林基因缺失会影响肾脏的保盐能力^[35]。在高盐饮食下，野生型小鼠和潘特林基因敲除小鼠的血压水平相似，但根据遥测系统的评价，低盐饮食时潘特林敲除小鼠的血压水平明显更低^[35]。

因此，潘特林是肾脏在生理变化过程中全面防止细胞外液丢失的必要条件。

潘特林急性丢失的影响也正在研究中。Trepiccione 等人利用Tet-on系统建立了一个模型，可应用潘特林敲除小鼠诱导潘特林的表达^[36]。在这个模型中，给予多西环素后，β-闰细胞可表达潘特林，但停用多西环素几天后，潘特林的表达几乎完全消失。研究者通过该模型发现，潘特林急性失活可使收缩压和舒张压在1周后下降约10 mmHg^[36]。

关于潘特林介导的NaCl重吸收，Leviel等人发现了一种协调Na+驱动Clˉ/HCO3ˉ交换体的机制^[37]，将1个Na+驱动Clˉ/HCO3ˉ交换体分子与2个潘特林分子耦合可导致电中性NaCl重吸收，而Na+驱动Clˉ/HCO3ˉ交换体和钠氯协同转运蛋白双敲除小鼠也表现出血容量减少^[38]。

与这些实验研究相一致，最新的临床数据表明，潘特林也在人类的血压调节中发挥作用。Kim等人研究了潘特林双等位基因突变者的血压和尿电解质^[39]，发现此类患者的血压较低，但是肾素和Na+、Clˉ的排泄分数较高，说明潘特林可通过调节尿盐排泄来调节血压。

除通过潘特林直接发挥作用外，闰细胞还可通过改变主细胞的功能而调节盐的转运^[40,41]。Guentin等人发现，在ATP6V1B1缺陷型小鼠中，肾皮质中ENaC的表达受到抑制^[40]。在此模型中观察到尿中前列腺素E2和ATP的水平增加，且用吲哚美辛抑制前列腺素E2，可减弱ENaC增幅。研究者进一步指出，在一个分离的皮质集合管系统中，给予H+-ATP酶抑制剂巴弗洛霉素可增加前列腺素E2的产生，而此作用可被ATP受体抑制剂苏拉明和ATP清除剂三磷酸腺苷双磷酸酶所抑制。这些观察结果表明，闰细胞中的H+-ATP酶是通过ATP和前列腺素E2来调节主细胞中ENaC活性的。

既往已经知道，闰细胞具有功能可塑性特征。AlAwqati等人在一系列的分析中证明，β-闰细胞可转变为α闰细胞^[42,43]。值得注意的是，最近的单细胞转录组分析显示，闰细胞有可能转变为主细胞。Park等人从58,000个肾组织细胞中获取了单细胞RNA数据，并应用此转录组分析对这些细胞进行了分类^[44]，在其中，研究者发现了一个意想不到的细胞类型，这类细胞除了表达闰细胞的标志物，如潘特林和H+-ATP酶以外，还表达主细胞的标志物，如ENaC、水通道蛋白2和11β-羟类固醇脱氢酶2型，因此认为这种新的细胞簇同时具有主细胞及闰细胞的特性。

运用体内追踪系统，研究者提出，闰细胞可经Notch信号通路可以转变为主细胞^[44]。这些数据为进一步研究闰细胞的可塑性和体液调节提供了新的途径。

众所周知，MR主要分布在主细胞中，但目前越来越多的研究表明相邻的闰细胞中也存在MR^[45-47]。盐皮质激素可增加顶端膜中潘特林的丰度，而在缺乏潘特林的小鼠中，由醛固酮和肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活引起的升压作用减弱^[32,35]。最近一项对远端肾小管的RNA测序研究也显示，醛固酮可上调潘特林的表达^[48]。但醛固酮对潘特林的影响可能并不明显，具体取决于生理环境^[49]，表明闰细胞中的MR信号可能是通过循环中醛固酮以外的其他机制调节的。

既往的几项研究表明，MR可被一些激酶磷酸化^[50-53]，但磷酸化在MR功能调节中的意义仍不清楚。通过一种磷酸化蛋白质组学的方法^[54]，我们在人类的MR中共定位了16个磷酸化位点^[47]。在已确定的磷酸化位点中，我们发现，配体结合域中S843位点的磷酸化几乎完全阻止了配体的结合和转录激活。值得注意的是，这种磷酸化几乎只能在体内实验的肾脏闰细胞中检测到。此位点的磷酸化受血浆K+水平和AngⅡ的双向调节，K+促进磷酸化，AngⅡ促进去磷酸化。这些数据表明，AngⅡ将无活性的磷酸化形式转化为有活性的去磷酸化形式可导致潘特林的丰度增加（醛固酮介导）。相反，高钾血症会关闭闰细胞中的MR信号转导，阻止醛固酮诱导产生潘特林。

在后续研究中，我们更详细地检测了AngⅡ对MR-潘特林通路的调节^[35]。在切除了肾上腺的小鼠中，我们发现除非同时给予醛固酮，否则AngⅡ仅可降低MR-S843的磷酸化，但不增加闰细胞中潘特林的丰度。此外，采用低盐饮食时，潘特林缺陷型小鼠的血压水平低于野生型小鼠^[35]。

为了阐明AngⅡ促进MR-S843去磷酸化的机制，我们使用一种合成的含有S843的MR肽，对近200个克隆的人类激酶结构域进行高通量筛选分析。此分析筛选出了unc 51样激酶（unc 51-like kinases，ULKs），和其他几个较小程度的能够磷酸化该位点的激酶^[55]，对小鼠肾脏的免疫荧光分析显示，集合管的闰细胞中富含ULK1。此外，以往应肽阵列的研究已确定Met或3位的Leu为ULK1介导的底物磷酸化的决定性因素^[56]，而ULK1与MR-S843周围的氨基酸序列一致。体外激酶分析、质谱分析和Ulk1ˉ/ˉUlk2ˉ/ˉ细胞系分析已证实ULK1介导MR-S843的磷酸化。

越来越多的数据表明，作为ULK1的上游信号机制，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target or rapamycin，mTOR）激酶可负向调节ULK1^[57,58]。因此，我们检测了AngⅡ对闰细胞中潘特林的作用是否是通过调节mTOR/ULK1轴来介导的。既往研究显示AngⅡ能够激活mTOR激酶^[59,60]，与这些研究一样，我们也发现AngⅡ介导的MR去磷酸化伴随着S6激酶（一种已知的mTOR复合物 1的底物）的磷酸化增加。此外，在体内和体外用药物抑制mTOR均可阻止AngⅡ介导的MR去磷酸化和诱导产生潘特林^[55]。重要的是，在输注了AngⅡ的小鼠中，抑制mTOR 可明显阻止盐依赖性血压升高，证明mTOR介导的潘特林诱导产生参与AngⅡ所致高血压的发生。

有趣的是，多项研究显示mTOR信号通路可能在其他器官的潘特林调节中发挥作用^[61,62]。Hosoya等人利用Pendred综合征特异性诱导性多功能干细胞建立了一种耳蜗细胞模型，发现这些细胞中的潘特林突变可导致细胞内聚合及细胞应激易感性增加，值得注意的是，此现象可被雷帕霉素（一种mTOR抑制剂）改善^[62]。尽管其作用机制尚不清楚，但mTOR抑制剂可能是通过减少潘特林突变体的表达来减少细胞聚集的。同样，在甲状腺滤泡细胞内潘特林和先天性甲状腺功能减退的调节中也有mTOR信号通路的参与^[61,63]。

关于MR和潘特林相关的潜在机制，最近一项研究报道显示，在肾脏闰细胞缺乏E3泛素连接酶Nedd4-2的小鼠中，顶端膜的潘特林丰度和皮质集合管的电中性Clˉ/HCO3ˉ交换均增加^[64]。在主细胞中，Nedd4-2是醛固酮信号通路机制中的一个下游效应因子，Nedd4-2可在此处通过N端的PY基序与ENaC结合，并通过多泛素化和降解来调节其丰度。MR信号通路通过诱导产生Sgk1来减弱这一过程，Sgk1使Nedd4-2中的S444磷酸化，减少Nedd4-2与ENaC之间的相互作用^[65]。检验MR信号通路的下游是否具有调节闰细胞中的潘特林的类似或相关机制，非常值得期待。

高血压、低钾血症和潘特林在醛固酮过量中的作用除了调节酸碱平衡和体液以外，一些证据表明潘特林还参与血浆K+水平的调节^[66-70]。反之，低钾血症可改变醛固酮诱导产生的潘特林和血压升高。与既往的数据一致^[31]，我们也发现醛固酮可增加质膜富集部分的潘特林丰度^[67]。但我们还发现，通过补充K+或使用阿米洛利（一种ENaC抑制剂）来纠正低钾血症可以防止潘特林上调^[67]。

重要的是，仅低钾血症本身（不输注醛固酮）并不能上调潘特林，这表明潘特林的产生必须同时具备低钾血症和醛固酮过量两个条件。这些发现与MR磷酸化水平的变化相关，也解释了醛固酮与低钾血症的协同作用^[67]。为了阐明此发现对K+稳态的生理学意义，我们比较了醛固酮对野生型小鼠和潘特林敲除小鼠血浆K+水平的影响。正如所预期的那样，潘特林敲除小鼠的尿液pH值明显较低，这与排碱的作用一致。最重要的是，我们发现，与同窝出生的野生型小鼠相比，潘特林敲除小鼠的血浆K+水平呈逐渐下降的趋势^[67]。最近的一项研究也支持潘特林在肾脏处理 K+的过程中发挥作用，该研究显示，在携带WNK4错义突变（Q562E）的假性醛固酮减少症Ⅱ型小鼠模型中，潘特林缺失可纠正高钾血症^[66]。如前所述，既往研究显示，醛固酮对敲除了潘特林的小鼠的升压效果减弱^[31]。综上所述，这些数据表明醛固酮所致的潘特林上调可调节血压升高与K+分泌之间的平衡，进而在醛固酮过量状态下调节血压与血浆K+的水平。

值得注意的是，有几项研究报道Pendred综合征患者存在严重的低钾血症，进一步支持潘特林在调节K+稳态中的作用^[68-70]。例如，Pela等报告，1例Pendred 综合征患儿接受噻嗪类利尿剂治疗后，出现了低钾血症 （K+=1.7 mmol/l）和低氯血症（Clˉ=70 mmol/l） ^[70]。其他研究则报告成人因饮酒过量和呕吐而引发严重低钾血症（K+<1.5 mmol/l）的病例^[68,69]。这些病例表现出尿K+水平异常升高，提示Pendred综合征患者肾脏维持机体K+平衡的能力受损。

迄今为止的研究表明，潘特林是在远端肾单位醛固酮信号通路下游调节体液和血压的关键成分之一。此外，潘特林还参与调节K+稳态和酸碱平衡。由于Pendred综合征患者基础状态下并不会出现明显的电解质异常，因此推测潘特林的功能可能被其他机制所代偿，但β-闰细胞缺乏潘特林会对体液和电解质平衡产生严重影响，这一影响在口服电解质或其他小管细胞的电解质传输机制受损时尤为明显。目前的证据也提示潘特林参与醛固酮相关的病理过程。

在肾脏中，AngⅡ下游的mTOR信号通路通过促进MR去磷酸化来调节潘特林的丰度。有趣的是，越来越多的证据表明，mTOR参与血压调节^[71]，以及肾小管对Na+和K+的处理过程^[72,73]。因此，mTOR可能参与肾脏电解质转运的多条通路，但需要进一步的研究来阐明其具体机制。

如本文所述，潘特林在醛固酮所致高血压的病理生理中发挥重要作用。潘特林是否参与其他继发性高血压如糖皮质激素过度生成相关性高血压^[74]及甘草诱导性高血压的发生，也非常值得探讨。